Una gran variedad de virus, bacterias, hongos y parásitos son los causantes de enfermedades infecciosas que, según estadísticas, producen alrededor de 15 millones de muertes a nivel mundial. La aparición y la recurrencia de enfermedades infecciosas ha creado grandes desafíos para la salud pública y estabilidad socioeconómica a nivel mundial. A pesar del uso de vacunas, antimicrobianos y antivirales para mitigar la mortalidad y morbilidad, su eficacia puede disminuir con la aparición de nuevos agentes patógenos, resistencia a antibióticos o por falta de concientización de prevención y medicación adecuada.
En este orden de ideas, la selección de métodos de detección apropiados para identificar de forma rápida y precisa los patógenos es la vía más eficaz para hacer frente a este problema de salud pública, ya que, mejorar la eficacia de diagnóstico permite dar tratamientos oportunos y reducir su propagación. Y en el presente artículo se abordará el estado actual dei diagnóstico de enfermedades infecciosas, etapas de la PCR y las nuevas plataformas de PCR para biología molecular de Molbio.
ESTADO ACTUAL DEL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Las técnicas de diagnóstico convencionales incluyen cultivos microbianos, detección de antígenos o inmunofluorescencia. En el caso de la microbiología, el tiempo de entrega de resultados es a partir de tres días y se basa principalmente en una identificación morfológica y bioquímica de las bacterias por lo que su especificidad y sensibilidad es baja o moderada dependiendo de los tipos de medios, condiciones de crecimiento e inocuidad. Por otra parte, las técnicas inmunológicas son sencillas y el tiempo de entrega del resultado es menor a un día, sin embargo, tienen altas tasas de falsos positivos y mala estabilidad térmica.
Debido a esta problemática se han concentrado esfuerzos para el desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular, basándose en el análisis de secciones únicas de ADN o ARN del material genético de cada patógeno, lo cual proporciona una opción altamente específica, sensible y rápida para la identificación de virus, hongos, bacterias y su resistencia a antibióticos.
La aplicación del diagnóstico molecular ofrece un progreso revolucionario en la medicina. Actualmente, existen varias técnicas moleculares para la detección de varias patologías como la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR y sus variaciones, tecnología de microarrays, secuenciación Sanger y secuenciación de nueva generación o NGS. Cabe resaltar que, la técnica más empleada es la PCR (desarrollada en 1983 por Kary Mullis) y se basa en la reacción enzimática de la polimerasa para amplificar o hacer varias copias de un segmento de ADN o ADNc definido por oligonucleótidos denominados primers que se unen de forma específica a la cadena de ADN molde.
ETAPAS DE LA PCR CONVENCIONAL:
El proceso de PCR se compone de tres etapas base: denaturación, annealing y extensión; en la primera etapa (denaturación) la doble hélice del material genético se separa debido al incremento de la temperatura obteniendo como resultado moléculas de una sola cadena.
En la segunda etapa (annealing), los primers se unen a la secuencia específica de las cadenas separadas para la cual fueron diseñados.
Finalmente, en la tercera etapa (extensión), la polimerasa copia la cadena de ADN usando los primers como andamio y dNTPs (desoxinucleotidos trifosfato) como “bloques de construcción”, es decir, al culminar la extensión se obtienen un duplicado del número de cadenas originales. Este proceso de tres etapas se repite por 30 a 40 ciclos, por lo tanto, se obtiene más de un billón de copias de la secuencia diana. Esta cantidad se detecta de forma cuantitativa o cualitativa para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
VARIACIONES DE LA PCR:
Existen distintas variaciones de la PCR que se usan en diagnóstico de enfermedades infecciosas y estás son:
- RT-PCR: que aplica la retrotranscripción para detectar patógenos cuyo material genético es de ARN.
- qPCR: para observar en tiempo real la amplificación de la secuencia diana obteniendo el resultado de forma cuantitativa.
- PCR multiplex que detecta varios genes target en un mismo ensayo, y la combinación de éstas.
